合作单位：Jiangxi Normal University

魔德科技：帮助客户研究异槲皮素与卵清蛋白的分子识别以及荧光淬灭机制

参考文献： Food Chemistry. 2020, 309, 125667. DOI: 10.1016/j.foodchem.2019.125667 （IF = 6.306 一区top期刊）

背景

卵清蛋白（OVA）是一种球状蛋白质，与其他可食用蛋白质相比，具有更高的营养价值、发泡能力、乳化性能和抗氧化能力，因此被广泛用于食品制造行业。但是，在食物的加热加工过程中，OVA可能会发生糖化反应，蛋白质的糖基化可以增强蛋白质的功能特性，但也可以诱导一些有害的糖基化产物生成，如AGEs、丙烯酰胺等。

研究表明，糖基化抑制剂可以一定程度上缓解蛋白质的糖基化并减少AGEs生成。黄酮类化合物具有较强的抗糖基化能力，但目前尚未有异槲皮素抗糖基化活性的研究。

方案设计

鉴于目前异槲皮素抗糖基化的作用机制仍不明确，因此本研究主要采用光谱-质谱方法研究异槲皮素抑制OVA糖基化的作用机制。为了深入研究异槲皮素与OVA的分子识别，经与魔德科技（www.modekeji.cn）技术团队沟通，拟采用分子模拟方法从原子层面获得异槲皮素与OVA的复合物结构，并从分子结构方面分析异槲皮素抗糖基化的机理。

主要结果

本文首先分别检测了不同浓度的异槲皮素对OVA荧光强度的影响，结果表明异槲皮素对OVA蛋白的荧光具有较强的淬灭作用。

图2 分析了异槲皮素的结合对OVA的荧光的影响，结构表明异槲皮素可以影响OVA蛋白荧光生色团附近的微环境。通过同步荧光分析可以发现，异槲皮素主要是影响了OVA蛋白中的酪氨酸和色氨酸附近的极性，进而使蛋白整体荧光淬灭。

经与魔德科技技术团队沟通商量，本文拟采用分子对接方法来研究异槲皮素和OVA蛋白的结合模式，进一步分析异槲皮素使蛋白荧光淬灭的主要作用机制，对接结果如图3-4所示。从图中可以看出，异槲皮素主要结合在蛋白的疏水性空腔内部，并与周围的氨基酸形成了较强的氢键和疏水相互作用，还可以与Y125形成π-π堆积作用。

通过分子模拟可以发现，氢键，范德华力和疏水作用是异槲皮素与OVA分子识别的重要结合力，这也进一步验证和补充了前面的热力学分析结果。

拓展知识

ECD计算方法：首先优化化合物基态的分子结构，计算从基态到一批激发态的激发能和振子强度，然后根据这两个量用高斯函数展宽，即可以得到化合物的紫外-可见吸收（UV-Vis）光谱，若用转子强度代替振子强度进行展宽，则可以得到ECD光谱。

合作单位：Zhejiang Ocean University

参考文献：Yuping Tang, Yafeng Zhou, Qiaojun Zhao, et al.. Process Biochemistry, 2020. DOI: 10.1016/j.procbio.2020.02.015 （IF = 3.06）

本文首次报道采用生物酶法通过MOT来制备奥利司他中间体（R）-MHOT，该研究成果为奥利司他的绿色合成奠定了基础。

背景：

奥利司他（Orlistat）是一种有效的，特异性的，长效胃肠道脂肪酶抑制剂，可以通过抑制脂肪酶来减少饮食中脂肪的吸收，进而减轻体重。目前，奥利司他的获得途径主要分两种：以天然产物利普斯他汀（Lipstatin）为起始物进行结构修饰得到；或者采用天然产物全合成方法。然而，利普斯他汀难以提取，导致患者难以负担昂贵的医药费用。而全合成方法可以减少花费，是目前制备奥利司他的主要方法。

（R）-MHOT是合成奥利司他过程中非常关键的中间体，目前获得（R）-MHOT的方法主要有化学合成和生物合成两种。化学方法由于ee值低，花费高等缺点难以大规模生产，因此生物合成方法是目前最具前景的合成方法。

近年来，还原酶在手性化合物的合成中发挥着重要的作用，大量的手性化合物都可以采用还原酶来合成。然而目前还没有还原酶不对称还原MOT产生（R）-MHOT的相关报道。本文根据之前研究的成果，采用NaSDR-G145A/I199L酶催化还原MOT产生（R）-MHOT，产量达到50 g/L。并采用分子模拟方法对该酶与MOT的结合模式及突变体产率增加的机制进行了深入研究。

方案设计：

作者先构建得到NaSDR及G145A/I199L突变体重组蛋白，并在不同温度，pH等条件下测试酶对MOT的催化效率。最后采用分子模拟方法，研究了酶及突变体与MOT的最适催化构象，并解释了突变体产率增加的原因。

主要结果：

在非线性回归的分析基础上，NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的Km值分别为0.08和0.11 mM，而野生型和突变体的kcat值分别为0.90/s和2.91/s，突变之后该酶的催化效率提高了3倍以上。

通过测试不同pH和不同实验温度对酶活性的影响，发现在pH=7和35℃附近，该酶具有较好的催化能力，如下图所示。

最后，本文采用分子对接方法研究了NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的最佳构象进行了研究。首先采用同源模建方法得到蛋白的三维结构并进行合理性评估。再将MOT分别对接到NaSDR和NaSDR-G145A/I199L的催化活性位点，结果如图2所示。从图中可以看出，MOT主要可以结合在蛋白的疏水空腔中，与辅酶NADH具有较近的距离，适合催化反应的发生。

为了进一步研究突变前后MOT与蛋白的结合差异以及引起催化效率变化的主要原因，图3分析了MOT与周围氨基酸残基的相互作用情况。从图中可以看出，MOT主要结合在由Ile89, Val144, Met195, Leu196, Val214, Phe260 和NADH组成的疏水性口袋中。Ser143和Tyr156可以作为氢键供体与MOT形成氢键相互作用。而突变体中，Gly145突变为Ala145，Ile199突变为Leu199，可以进一步增强活性位点的疏水性质，进而增强MOT与突变体的结合能（由-5.02增加到-5.61 kcal/mol）。并且在突变之后，MOT中的羰基碳原子与NADH的催化距离由3.00 Å减小到2.73 Å，进一步证明了突变之后更有利于MOT的催化反应。

总的来讲，本文通过实验证明了NaSDR-G145A/I199L在35℃、中性条件下催化MOT产生（R）-MHOT的产量达到了50g/L，并通过分子模拟方法从原子层面解释了突变体产量提升的可能原因。定点突变或定向进化技术可以进一步提高该酶的催化能力，并用于大规模制备中间体（R）-MHOT。

合作单位：Yangtze Normal University

魔德科技：完成分子对接和结合模式的分析

参考文献：Xiaoping, Tan, Yang, et al.. Sensors, 2018. DOI: 10.3390/s18113927 （IF = 3.72）

本文首次采用竞争性主客体识别方法，研究了阳离子柱[5]芳烃（CP5）与左旋肉碱的相互作用与传感机制。并利用CP5功能化的金纳米粒子构建了荧光传感平台（CP5@Au-NPs）作为受体，以对左旋肉碱具有高度敏感性和选择性的罗丹明123作为探针。该荧光传感平台可以用来检测人血清和牛奶中的左旋肉碱，为及时发现药物滥用并解决食品安全问题提供了指导。

背景：

金纳米材料Au-NPs具有易合成，化学稳定性高，容易表面功能化修饰等优点，因此引起了纳米技术和纳米材料领域研究人员的极大兴趣，金纳米材料的应用非常广泛，包括生物医药，传感器，催化和纳米电子学等。金纳米粒子与表面配体的相互作用也是许多应用的关键问题，例如，适当地改变纳米粒子表面的性质可以大大提高其传感器的电位。

大环芳烃在超分子化学方面具有非常重要的作用，柱芳烃是继冠醚，杯芳烃，环糊精和瓜环后，第五代大环主体分子，由Ogoshi等人在2008年首次报道。柱芳烃主要包括柱5芳烃和柱6芳烃，均由亚甲基桥连接，形成独特的刚性支柱结构。虽然目前对于柱芳烃的研究较多，但其与金纳米材料的结合以及所得杂化纳米材料的应用仍然鲜有报道。

左旋肉碱是一种天然物质，在人体脂肪酸氧化及能量的产生过程中具有关键的作用，缺乏该种物质会导致毒性的游离脂肪酸累积。因此目前有很多检测左旋肉碱的方法，比如色谱法，毛细管电泳，伏安法和荧光法等。但是目前仍然需要一种高灵敏性的工具来检测左旋肉碱。

本文主要描述了一种简单便捷的在柱[5]芳烃和左旋肉碱之间的“开关”式荧光传感平台，该平台以CP5@Au-NPs作为受体，罗丹明123作为探针分子，罗丹明对左旋肉碱具有较强的选择性和敏感性。

方案设计：

作者先构建出CP5@Au-NPs荧光传感平台，并经过荧光测试具有较好的检测左旋肉碱的效果。但CP5与左旋肉碱之间的识别模式以及二者结合的驱动力尚不清楚，因此魔德科技采用分子模拟方法对主客体之间的结合模式进行了分子层面的研究。

主要结果：

从图中可以看出R123的荧光强度在CP5@Au-NPs体系中出现了明显的淬灭现象，并且随着CP5@Au-NPs的浓度不断增加，罗丹明123的荧光强度不断降低，因此，R123可以依靠主客体相互作用与CP5结合。而当加入左旋肉碱之后，罗丹明123的荧光强度发生了逆转，逐渐增强。总的来讲，罗丹明123可以进入CP5的空腔中与其结合，并在加入左旋肉碱之后，由于竞争性的作用，左旋肉碱可以与CP5结合，并导致罗丹明的结合减弱。因此，这是一种“开关”模式。

本文采用了分子对接方法研究了CP5与左旋肉碱之间的识别模式。分子对接采用AutoDock 4.2.6软件包，由于CP5的空腔大小和左旋肉碱的分子大小，二者采用1:1的结合模式。从图中可以看出，左旋肉碱结构中带负电荷的羧基可以与CP5结构中带正电荷的N原子形成较强的静电吸引作用。而左旋肉碱的带正电荷的季氨基可以与CP5的苯环形成cation-π相互作用。

最后，本文采用1H-NMR方法对CP5与左旋肉碱的分子识别机制进行了研究。从图中可以看出左旋肉碱中的Ha和Hb质子的光谱在结合CP5之后消失了。由此可以证明CP5能够有效识别左旋肉碱分子并释放罗丹明123。