四川魔德科技有限公司
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Cell Reports | UMPylation修饰在关键时刻保细菌一命

博客文章, 成功案例

​合作单位:ShandongFirst Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences

魔德科技:采用分子模拟方法研究YdiU蛋白与UTP/ATP的分子识别

参考文献:Cell Report. 2020, 32(12), 108161. DOI: 10.1016/j.celrep.2020.108161(IF = 12.60)

  • 背景

沙门氏菌对周围环境的变化具有比较明显的感受,为了适应这种变化,细菌会调整胞内的生命活动。蛋白的翻译后修饰(PTMs)是一种可以迅速传导胞内信号的方式,参与了细菌体内多种生命活动过程,其中磷酸化和乙酰化是常见的PTMs类型。随着实验技术的不断发展,有一些其他的PTMs类型被鉴定出来,但是对于新型的PTMs类型,其在细菌生命活动中的产生方式和功能尚不清楚。

本研究报道了一种YdiU蛋白催化的新型PTMs类型——单磷酸尿苷酸化修饰(UMPylation)。通过解析晶体结构发现UMPylation主要发生在蛋白的酪氨酸和组氨酸上。另外研究表明,当体内的ATP不足时,YdiU蛋白可以利用另一种核苷酸UTP来实现对蛋白的UMPylation修饰,并且在Mn2+离子存在下,可以显著提高YdiU蛋白与UTP的亲和力,而对于ATP却没有明显的作用。由于目前实验条件的限制,可以获得YdiU-ATP的晶体结构(PDB ID: 6LNA),但很难获得YdiU-UTP的晶体结构。

  • 方案设计

鉴于目前实验条件很难获得YdiU-UTP的晶体结构,为了深入研究YdiU利用UTP进行UMPylation修饰的作用机制,经与四川魔德科技(www.modekeji.cn)技术团队深入沟通,拟基于YdiU-ATP的晶体结构,采用分子模拟方法获得YdiU与UTP的复合物结构,并研究Mn离子对ATP和UTP与YdiU蛋白亲和力的影响。

  • 主要结果

1、偶然发现: UMP而非AMP

YdiU蛋白家族是广泛存在与细菌中的保守蛋白家族,被预测为无活性的“假激酶”,是最具研究价值的未知功能蛋白家族之一。在本文之前,一直认为该类蛋白家族可能具有催化蛋白单磷酸腺苷酸化(AMPylation)修饰的活性。但本文在研究YdiU蛋白的功能时,发现只有在压力应激条件下,沙门氏菌才启动YdiU蛋白的表达,深入分析之后,发现YdiU蛋白表达之后,沙门氏菌体内46个蛋白中均发现了一种新型的蛋白结构修饰——UMPylation,却并没有发现AMPylation修饰的蛋白。

图1 YdiU蛋白在ATP缺乏时进行UMP修饰的示意图



2、YdiU-UTP催化UMPylation修饰的机制研究

进一步研究发现,UMPylation修饰主要发生在蛋白的酪氨酸和组氨酸上,周围还存在大量的疏水氨基酸和负电荷氨基酸。另外还发现Mn2+离子在UMPylation修饰过程中具有非常重要的作用。亲和力数据表明Mn2+可以显著提高YdiU与UTP的亲和力,而对ATP的亲和力却没有显著作用。但实验手段难以解析获得YdiU-UTP-Mn2+的晶体结构。因此本研究采用分子动力学模拟方法构建并优化了YdiU-UTP-Mn2+的模型。

分子动力学模拟结果表明,UTP与YdiU的结合明显更强,主要体现在Mn2+离子与周围氨基酸残基的配位作用。如下图所示,在YdiU-ATP-Mn2+体系中,Mn1离子只与周围3个氧原子配位,Mn2与周围4个氧原子配位,而在YdiU-UTP-Mn2+体系中,2个Mn离子均与周围的氧原子形成了5个配位。另外,通过对比ATP和UTP与YdiU-Mn2+的结合模式,可以发现D246在与Mn的配位出现了比较明显的变化,在UTP体系中,D246更容易与Mn2+离子配位。通过计算结合自由能也可以发现,ATP和UTP与YdiU的结合自由能分别为-25.93kcal/mol和-28.61 kcal/mol。

综上所述,通过分子模拟研究,可以发现,ATP和UTP与YdiU-Mn2+的结合模式有一定程度的差异,主要体现在Mn离子的配位和D246的构象变化,这可能是YdiU蛋白与UTP亲和力更强的主要原因之一。

图2ATP/UTP与YdiU-Mn2+的结合模式图


表1ATP和UTP与YdiU蛋白的结合自由能的贡献




3、UMPylation修饰调控分子伴侣功能

为了进一步研究UMPylation修饰调控分子伴侣的机制,本研究分析了UMPylation修饰的具体氨基酸位点,发现UMPylation修饰位点均发生在分子伴侣与底物或辅因子结合的界面上。

研究表明,YdiU的UMPylation修饰可以明显抑制DnaK和GrpE的结合,同时还阻碍了GroEL与底物的结合。研究证明,UMPylation修饰作为一种负调控机制可以关闭分子伴侣的功能。

图3 UMPylation修饰可以阻止伴侣蛋白与底物或辅因子的结合

  • 看点

当细菌遭受压力环境时,分子伴侣的功能主要是帮助损伤的蛋白进行快速修复,这个过程会消耗大量的ATP。本研究发现,在压力环境下,细胞内的ATP严重不足,这时YdiU蛋白可以在UTP的作用下,发挥UMPylation修饰的功能,对分子伴侣蛋白进行修饰,关闭其修复功能。进而保护细菌在压力环境下,不会因为ATP大量消耗而衰竭致死。

2022年5月13日/通过: admin
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/21109.png 504 706 admin http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png admin2022-05-13 18:00:402022-05-13 23:30:29Cell Reports | UMPylation修饰在关键时刻保细菌一命

分子模拟探究蛋白质荧光淬灭机制

成功案例

合作单位:Jiangxi Normal University

魔德科技:帮助客户研究异槲皮素与卵清蛋白的分子识别以及荧光淬灭机制

参考文献: Food Chemistry. 2020, 309, 125667. DOI: 10.1016/j.foodchem.2019.125667 (IF = 6.306 一区top期刊)

背景

卵清蛋白(OVA)是一种球状蛋白质,与其他可食用蛋白质相比,具有更高的营养价值、发泡能力、乳化性能和抗氧化能力,因此被广泛用于食品制造行业。但是,在食物的加热加工过程中,OVA可能会发生糖化反应,蛋白质的糖基化可以增强蛋白质的功能特性,但也可以诱导一些有害的糖基化产物生成,如AGEs、丙烯酰胺等。

研究表明,糖基化抑制剂可以一定程度上缓解蛋白质的糖基化并减少AGEs生成。黄酮类化合物具有较强的抗糖基化能力,但目前尚未有异槲皮素抗糖基化活性的研究。

方案设计

鉴于目前异槲皮素抗糖基化的作用机制仍不明确,因此本研究主要采用光谱-质谱方法研究异槲皮素抑制OVA糖基化的作用机制。为了深入研究异槲皮素与OVA的分子识别,经与魔德科技(www.modekeji.cn)技术团队沟通,拟采用分子模拟方法从原子层面获得异槲皮素与OVA的复合物结构,并从分子结构方面分析异槲皮素抗糖基化的机理。

主要结果

本文首先分别检测了不同浓度的异槲皮素对OVA荧光强度的影响,结果表明异槲皮素对OVA蛋白的荧光具有较强的淬灭作用。

异槲皮素对OVA荧光强度以及蛋白内荧光的影响
图1 异槲皮素对OVA荧光强度以及蛋白内荧光的影响

图2 分析了异槲皮素的结合对OVA的荧光的影响,结构表明异槲皮素可以影响OVA蛋白荧光生色团附近的微环境。通过同步荧光分析可以发现,异槲皮素主要是影响了OVA蛋白中的酪氨酸和色氨酸附近的极性,进而使蛋白整体荧光淬灭。

异槲皮素对OVA的同步荧光影响
图2 异槲皮素对OVA的同步荧光影响

经与魔德科技技术团队沟通商量,本文拟采用分子对接方法来研究异槲皮素和OVA蛋白的结合模式,进一步分析异槲皮素使蛋白荧光淬灭的主要作用机制,对接结果如图3-4所示。从图中可以看出,异槲皮素主要结合在蛋白的疏水性空腔内部,并与周围的氨基酸形成了较强的氢键和疏水相互作用,还可以与Y125形成π-π堆积作用。

异槲皮素与OVA蛋白表面的亲疏水匹配图(蓝色和橙色部分分别表示亲水和疏水区域)
图3 异槲皮素与OVA蛋白表面的亲疏水匹配图(蓝色和橙色部分分别表示亲水和疏水区域)
异槲皮素与卵清蛋白的结合模式
图4 异槲皮素与卵清蛋白的结合模式

通过分子模拟可以发现,氢键,范德华力和疏水作用是异槲皮素与OVA分子识别的重要结合力,这也进一步验证和补充了前面的热力学分析结果。

拓展知识

ECD计算方法:首先优化化合物基态的分子结构,计算从基态到一批激发态的激发能和振子强度,然后根据这两个量用高斯函数展宽,即可以得到化合物的紫外-可见吸收(UV-Vis)光谱,若用转子强度代替振子强度进行展宽,则可以得到ECD光谱。

2021年6月7日/通过: wyd
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2021/06/图片-9.png 330 327 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png wyd2021-06-07 09:24:122021-06-07 09:26:22分子模拟探究蛋白质荧光淬灭机制

手性化合物的“照妖镜”——电子圆二色谱法

成功案例

合作单位:Lanzhou University

魔德科技:帮助客户完成吡咯类反应产物的绝对构型确证

参考文献: Adv. Synth. Catal. 2019, 361, 1-8. DOI: 10.1002/adsc.201900481 (IF = 5.85 一区top期刊)

ECD与实验CD图对比
ECD与实验CD图对比

本文主要工作内容为利用α-异氰基乙酸酯(α-isocyanoacetates)和炔基酮(alkynyl ketones)作为前体,实现了基于Mg离子催化的2H-吡咯和3H-吡咯类化合物的不对称合成。最后,使用电子圆二色谱(ECD)方法确认了合成产物的手性。

背景:

目前多功能吡咯环在药物研究和分子传感器等研究领域具有极高的应用价值,因此如何合成具有构象选择性的吡咯环成为了当前研究的热点。合成手性吡咯环常用的策略是采用不对称氢化脱芳构化和环化反应,常用的反应物包括手性吡咯烷和二氢吡咯,但是截止目前,构建富含对映体的2H-吡咯和3H-吡咯仍然非常困难。因此,本文拟采用α-异氰基乙酸酯和炔烃之间的环化反应来构建对映体富集的2H-吡咯化合物,并在反应过程中采用Mg(II)离子催化。

方案设计:

作者先通过在课题组研究成果的基础上,设计了α-异氰基乙酸酯和炔烃的环化来合成2H-吡咯和3H-吡咯的反应过程,并使用Mg(II)作为反应的催化剂,优化反应条件。最后,为了确认反应产物的绝对构型,经与魔德科技(www.modekeji.cn)技术团队沟通,拟采用电子圆二色谱(ECD)方法计算产物构型的圆二色谱图,并与实验测得产物的圆二色谱(CD)进行比对,进而确认反应产物的绝对构型。

吡咯合成路径

主要结果:

本文先对反应的条件进行了筛选,包括反应物,溶剂,温度等条件。最后获得的反应的er值在81.5:18.5到98:2范围。

反应条件优化
化学反应式

最后为了确认反应产物的绝对构型,在魔德科技的协助下完成了ECD的计算和分析,确认了2H-吡咯和3H-吡咯反应产物的绝对构型,如下图所示。本文采用的计算水平为TD-B3LYP/6-311G(d),并考虑甲醇隐式溶剂模型。

ECD与CD对比图

通过对比计算得到的ECD和实验CD图,可以发现二者具有较强的吻合性。因此可以证明,两个吡咯类化合物的绝对构型均为S构型。

拓展知识

电子光谱的计算原理:首先优化化合物基态的分子结构,计算从基态到一批激发态的激发能和振子强度,然后根据这两个量用高斯函数展宽,即可以得到化合物的紫外-可见吸收(UV-Vis)光谱,若用转子强度代替振子强度进行展宽,则可以得到ECD光谱。

2021年6月3日/通过: wyd
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2021/06/图片.png 253 327 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png wyd2021-06-03 16:56:422021-06-03 16:56:42手性化合物的“照妖镜”——电子圆二色谱法

短链脱氢酶催化合成奥利司他中间体的机制研究

成功案例

合作单位:Zhejiang Ocean University

参考文献:Yuping Tang, Yafeng Zhou, Qiaojun Zhao, et al.. Process Biochemistry, 2020. DOI: 10.1016/j.procbio.2020.02.015 (IF = 3.06)

本文首次报道采用生物酶法通过MOT来制备奥利司他中间体(R)-MHOT,该研究成果为奥利司他的绿色合成奠定了基础。

背景:

奥利司他(Orlistat)是一种有效的,特异性的,长效胃肠道脂肪酶抑制剂,可以通过抑制脂肪酶来减少饮食中脂肪的吸收,进而减轻体重。目前,奥利司他的获得途径主要分两种:以天然产物利普斯他汀(Lipstatin)为起始物进行结构修饰得到;或者采用天然产物全合成方法。然而,利普斯他汀难以提取,导致患者难以负担昂贵的医药费用。而全合成方法可以减少花费,是目前制备奥利司他的主要方法。

(R)-MHOT是合成奥利司他过程中非常关键的中间体,目前获得(R)-MHOT的方法主要有化学合成和生物合成两种。化学方法由于ee值低,花费高等缺点难以大规模生产,因此生物合成方法是目前最具前景的合成方法。

近年来,还原酶在手性化合物的合成中发挥着重要的作用,大量的手性化合物都可以采用还原酶来合成。然而目前还没有还原酶不对称还原MOT产生(R)-MHOT的相关报道。本文根据之前研究的成果,采用NaSDR-G145A/I199L酶催化还原MOT产生(R)-MHOT,产量达到50 g/L。并采用分子模拟方法对该酶与MOT的结合模式及突变体产率增加的机制进行了深入研究。

方案设计:

作者先构建得到NaSDR及G145A/I199L突变体重组蛋白,并在不同温度,pH等条件下测试酶对MOT的催化效率。最后采用分子模拟方法,研究了酶及突变体与MOT的最适催化构象,并解释了突变体产率增加的原因。

主要结果:

在非线性回归的分析基础上,NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的Km值分别为0.08和0.11 mM,而野生型和突变体的kcat值分别为0.90/s和2.91/s,突变之后该酶的催化效率提高了3倍以上。

表1 NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化的动力学参数

通过测试不同pH和不同实验温度对酶活性的影响,发现在pH=7和35℃附近,该酶具有较好的催化能力,如下图所示。

图1 pH(a)和温度(b)对NaSDR-G145A/I199L活性的影响

最后,本文采用分子对接方法研究了NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的最佳构象进行了研究。首先采用同源模建方法得到蛋白的三维结构并进行合理性评估。再将MOT分别对接到NaSDR和NaSDR-G145A/I199L的催化活性位点,结果如图2所示。从图中可以看出,MOT主要可以结合在蛋白的疏水空腔中,与辅酶NADH具有较近的距离,适合催化反应的发生。

图2 蛋白结构评估的拉氏图(a)和ERRAT值分布(b),MOT在NaSDR(c)和NaSDR-G145A/I199L(d)活性位点的结合模式

为了进一步研究突变前后MOT与蛋白的结合差异以及引起催化效率变化的主要原因,图3分析了MOT与周围氨基酸残基的相互作用情况。从图中可以看出,MOT主要结合在由Ile89, Val144, Met195, Leu196, Val214, Phe260 和NADH组成的疏水性口袋中。Ser143和Tyr156可以作为氢键供体与MOT形成氢键相互作用。而突变体中,Gly145突变为Ala145,Ile199突变为Leu199,可以进一步增强活性位点的疏水性质,进而增强MOT与突变体的结合能(由-5.02增加到-5.61 kcal/mol)。并且在突变之后,MOT中的羰基碳原子与NADH的催化距离由3.00 Å减小到2.73 Å,进一步证明了突变之后更有利于MOT的催化反应。

图3 MOT与NaSDR(a)和NaSDR-G145A/I199L(b)活性位点氨基酸残基的相互作用,MOT在突变前后关键的催化距离变化(c)

总的来讲,本文通过实验证明了NaSDR-G145A/I199L在35℃、中性条件下催化MOT产生(R)-MHOT的产量达到了50g/L,并通过分子模拟方法从原子层面解释了突变体产量提升的可能原因。定点突变或定向进化技术可以进一步提高该酶的催化能力,并用于大规模制备中间体(R)-MHOT。

2020年4月8日/通过: wyd
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2020/04/图片-11.png 618 554 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png wyd2020-04-08 15:54:252021-06-03 16:59:39短链脱氢酶催化合成奥利司他中间体的机制研究

一种新型N-酰基高丝氨酸内酯合酶底物特异性结构研究

成功案例

合作单位:Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province

参考文献:L Jin, XJ Zhang, H Shi, W Wang, ZH Qiao, WG Yang, and WY Du. J. Agric. Food Chem., 2020, 68(8): 2516-2527. DOI: 10.1021/acs.jafc.9b07833 (IF = 3.80 一区top期刊)

在革兰氏阴性细菌嗜水气单胞菌中,N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)介导的群体感应(QS)影响致病性,蛋白质分泌和运动性。本文从分离的嗜水气单胞菌HX-3中克隆了AhyI基因,并首次证实该蛋白可以催化产生六种类型的AHL,而不是常规认为的两种。

背景:

嗜水气单胞菌(A. hydrophila)是一种革兰氏阴性菌,被称为人和动物的机会致病菌。A. hydrophila在水产养殖环境中无处不在,并导致鱼类,虾和蟹的疾病。食用受污染的水生动物后,人类可能会感染并发展为败血症,肠胃炎,骨髓炎和腹膜炎等。因此,近年来亲水型链球菌对食品安全的重要性已经成为人们广泛关注的问题。迄今为止,三种典型的亲水性在嗜水气单胞菌中已经发现了自动诱导物(AI)系统,包括基于AHL的自动诱导物AI-1系统,依赖S-核糖基同型半胱氨酸酶(LuxS)的自动诱导物AI-2系统,以及基于QseB / QseC的自动诱导物AI -3系统。

AHL合酶LuxI催化的AHL生物合成机制已证明涉及酰基从酰化酰基载体蛋白(酰基-ACP)到S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)氨基的转移。涉及酰基-SAM中间体的酰基转移反应被认为是在羧化氧的内酯化形成AHL产物和S-甲基硫代腺苷(MTA)之前发生的。最近,LuxI的同系物,BjaI仅使用酰基辅酶A和SAM作为底物,通过特定的酰基SAM中间体进行内酯化形成AHL。有趣的是,BjaI的研究证明了乙酰辅酶A可以作为BjaI催化脂肪链底物产生AHL的因子,而不是酰基-ACP。AHL合成的独特机制表明,底物与其他LuxI合成酶的作用截然不同。 迄今为止,尚未报道在AHL合酶反应过程中具有结合的底物的AhyI的详细结构,尽管已鉴定出完整的氨基酸序列和AhyI的保守残基,但各个氨基酸残基的作用仍不清楚。本研究中,将嗜水链球菌HX-3的AhyI基因克隆到大肠杆菌中,并通过系统发育分析和多序列比对鉴定评估AhyI酶。同时采用分子模拟方法研究了AhyI-C4ACP-SAM和AhyI-C12/14ACP复合物的分子结构,并对该酶的催化机制进行了探讨。

方案设计:

作者先从嗜水链球菌HX-3中分理处AhyI基因,并克隆到大肠杆菌中,通过UPLC-MS / MS方法分析鉴定出由AhyI催化产生的6种AHL。但AhyI与不同底物的结合模式,以及催化产生不同AHL的作用机制尚不清楚,因此魔德科技采用分子模拟方法对AhyI与底物之间的分子识别机制展开了深入研究。

主要结果:

本文采用UPLC-MS / MS方法从链球菌和大肠杆菌中分离鉴定出6种不同的AHL产物,如图所示。

图1 AHL的质谱分析,由6种AHL标准品(a),嗜水链球菌HX-3(b)和大肠杆菌中重组AhyI蛋白(c)产生的总离子电流UPLC-MS/MS色谱图。嗜水性链球菌(d)和大肠杆菌(e)中鉴定出的不同AHL的相对百分比。

由于目前AhyI的晶体结构尚未解析出来,因此本文首先采用同源模建方法构建了AhyI蛋白的空间结构,然后采用Autodock 4.2.6程序将底物对接到AhyI蛋白的活性位点中,筛选得到合理的复合物结合构象。

结果表明,底物C4-ACP的脂肪链主要结合在AhyI蛋白中较深的疏水性口袋中(由疏水性氨基酸Ile67,Leu100,Leu103,Val144和Phe152组成),这些疏水性氨基酸提供的强疏水环境可以极大的增强底物脂肪链与蛋白的亲和力,并可以稳定底物构象,使其与SAM具有较好的催化距离。

图2 C4-ACP与AhyI蛋白活性位点的结合模式。A:C4-ACP和SAM在蛋白表面的结合模式,蓝色和橙色分别表示亲水和疏水性区域;b:底物与活性位点附近氨基酸的相互作用情况;c:底物在AhyI中的结合位置,紫色和青色分别表示α螺旋和β折叠;d:AhyI中相关氨基酸残基与C4-ACP的立体视图。

最近,Shin等人发现具有较短脂肪链的底物可能会结合在同源蛋白RhlI的激活口袋附近,而长链的底物分子可能结合在附近的抑制口袋中,因为抑制口袋具有更大的空间,并且具有较多的疏水性氨基酸残基。为了进一步研究AhyI能够催化长链底物的主要原因,本文将C12-ACP和C14-ACP分别与AhyI蛋白对接,结果如下图所示。值得注意的是,两个长链底物的非极性脂肪链占据了相同的口袋,该口袋与RhlI的抑制口袋位置一致。口袋的内部主要有大量的疏水性氨基酸组成。并且,AhyI与长链底物的结合模式中,Phe125和Phe152形成了一个“夹子”,可以固定住C12-ACP和C14-ACP尾部的甲基基团,这与同源蛋白RhlI中的Leu124-Val35和AiiA lactonase中的Phe64-Phe68非常相似。

图3 AhyI长酰基链特异性结合口袋与C12-ACP(a)和C14-ACP(b)的结合模式。

尽管本研究中提供的蛋白-底物复合物模型不足以更加深入理解AhyI的催化机理,但是可以合理地假设这些酶具有相似的机理,因为这些LuxI同源蛋白之间存在结构相似性。 尽管关于AhyI的这一假设仍有待证明,但我们对AhyI的结构功能将在未来展开更加深入的研究,并提供其催化机制的相关信息。

2020年4月7日/通过: wyd
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2020/04/1996-1.png 601 897 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png wyd2020-04-07 17:41:382021-06-03 16:59:46一种新型N-酰基高丝氨酸内酯合酶底物特异性结构研究

分子模拟在荧光传感平台中的应用——主客体相互作用研究

成功案例

合作单位:Yangtze Normal University

魔德科技:完成分子对接和结合模式的分析

参考文献:Xiaoping, Tan, Yang, et al.. Sensors, 2018. DOI: 10.3390/s18113927 (IF = 3.72)

本文首次采用竞争性主客体识别方法,研究了阳离子柱[5]芳烃(CP5)与左旋肉碱的相互作用与传感机制。并利用CP5功能化的金纳米粒子构建了荧光传感平台(CP5@Au-NPs)作为受体,以对左旋肉碱具有高度敏感性和选择性的罗丹明123作为探针。该荧光传感平台可以用来检测人血清和牛奶中的左旋肉碱,为及时发现药物滥用并解决食品安全问题提供了指导。

图1 罗丹明123、左旋肉碱和CP5的结构,荧光传感平台CP5@Au-NPs检测左旋肉碱的作用机制

背景:

金纳米材料Au-NPs具有易合成,化学稳定性高,容易表面功能化修饰等优点,因此引起了纳米技术和纳米材料领域研究人员的极大兴趣,金纳米材料的应用非常广泛,包括生物医药,传感器,催化和纳米电子学等。金纳米粒子与表面配体的相互作用也是许多应用的关键问题,例如,适当地改变纳米粒子表面的性质可以大大提高其传感器的电位。

大环芳烃在超分子化学方面具有非常重要的作用,柱芳烃是继冠醚,杯芳烃,环糊精和瓜环后,第五代大环主体分子,由Ogoshi等人在2008年首次报道。柱芳烃主要包括柱5芳烃和柱6芳烃,均由亚甲基桥连接,形成独特的刚性支柱结构。虽然目前对于柱芳烃的研究较多,但其与金纳米材料的结合以及所得杂化纳米材料的应用仍然鲜有报道。

左旋肉碱是一种天然物质,在人体脂肪酸氧化及能量的产生过程中具有关键的作用,缺乏该种物质会导致毒性的游离脂肪酸累积。因此目前有很多检测左旋肉碱的方法,比如色谱法,毛细管电泳,伏安法和荧光法等。但是目前仍然需要一种高灵敏性的工具来检测左旋肉碱。

本文主要描述了一种简单便捷的在柱[5]芳烃和左旋肉碱之间的“开关”式荧光传感平台,该平台以CP5@Au-NPs作为受体,罗丹明123作为探针分子,罗丹明对左旋肉碱具有较强的选择性和敏感性。

方案设计:

作者先构建出CP5@Au-NPs荧光传感平台,并经过荧光测试具有较好的检测左旋肉碱的效果。但CP5与左旋肉碱之间的识别模式以及二者结合的驱动力尚不清楚,因此魔德科技采用分子模拟方法对主客体之间的结合模式进行了分子层面的研究。

主要结果:

从图中可以看出R123的荧光强度在CP5@Au-NPs体系中出现了明显的淬灭现象,并且随着CP5@Au-NPs的浓度不断增加,罗丹明123的荧光强度不断降低,因此,R123可以依靠主客体相互作用与CP5结合。而当加入左旋肉碱之后,罗丹明123的荧光强度发生了逆转,逐渐增强。总的来讲,罗丹明123可以进入CP5的空腔中与其结合,并在加入左旋肉碱之后,由于竞争性的作用,左旋肉碱可以与CP5结合,并导致罗丹明的结合减弱。因此,这是一种“开关”模式。

图2 A:在10 μM的CP5和16 μM的CP5@Au-NPs存在下,罗丹明123的荧光强度;B:不同CP5@Au-NPs浓度对罗丹明123荧光淬灭的影响;C:不同浓度左旋肉碱对R123@CP5@Au-NPs复合材料荧光光谱的影响;D:R123@CP5@Au-NPs与左旋肉碱浓度荧光强度的校准曲线。

本文采用了分子对接方法研究了CP5与左旋肉碱之间的识别模式。分子对接采用AutoDock 4.2.6软件包,由于CP5的空腔大小和左旋肉碱的分子大小,二者采用1:1的结合模式。从图中可以看出,左旋肉碱结构中带负电荷的羧基可以与CP5结构中带正电荷的N原子形成较强的静电吸引作用。而左旋肉碱的带正电荷的季氨基可以与CP5的苯环形成cation-π相互作用。

图3 CP5与左旋肉碱的分子对接结合模式。A和B分别为俯视图和主视图;C和D分别为静电和疏水相互作用模式。

最后,本文采用1H-NMR方法对CP5与左旋肉碱的分子识别机制进行了研究。从图中可以看出左旋肉碱中的Ha和Hb质子的光谱在结合CP5之后消失了。由此可以证明CP5能够有效识别左旋肉碱分子并释放罗丹明123。

图4 1H-NMR光谱分析(a:左旋肉碱;b:CP5+左旋肉碱;c:CP5)

2020年4月7日/通过: wyd
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2020/04/图片-2.png 435 479 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png wyd2020-04-07 11:01:132021-06-03 17:03:01分子模拟在荧光传感平台中的应用——主客体相互作用研究

分子自组装(self-assembly)

成功案例
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2019年4月23日/通过: wyd
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2019/04/self-assembly.png 483 550 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png wyd2019-04-23 08:58:542019-06-14 15:22:33分子自组装(self-assembly)

PMH与LpxC的分子识别及3D-QSAR模型

成功案例

背景

内毒素脂质A(LA)的合成共有9个酶参与, 其中由LpxC基因编码的UDP-3-O-(R-羟基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶(LpxC)催化的脱乙酰反应是整个生物合成途径中的首个关键步骤,有效抑制LpxC能干扰LPS的合成,最终导致菌体细胞的死亡。另外, LpxC在G-菌中高度保守(超过40种),且在人和哺乳动物体内无同源性蛋白质。因此, LpxC是理想的抗菌酶Target,基于LpxC结构开发小分子将改善G-菌感染治疗困难的现状。

LpxC为一种锌离子依赖性金属酶,呈“ β-α-α-β”夹层结构, 由2个具有相似拓扑学结构的结构域(Domain Ⅰ和Domain Ⅱ)组成。 每个结构域分别含有1个独特的插入区(Insert Ⅰ和Insert Ⅱ)。插入区Ⅰ界定了活性位点的范围,并固定了具有催化活性的锌离子。基于该酶特殊的结构,近年来有多类分子相继被报道,大部分Inhibitors都含有能与锌离子结合、抑制其催化活性的基团和较长的疏水链,以适应酶的疏水通道。

本项工作中首先整合现有数据库ChEMBL 的文献报告,建立LpxC Inhibitors的虚拟库,然后选择38种PMH化合物和活性数据建立三维定量构效关系(3D-QSAR)模型。通过分子动力学模拟探索PMH LpxC Inhibitors可能的作用机制,为PMH LpxC Inhibitors的活性预测,分子设计和修饰提供理论依据。

目的

通过研究PMH inhibitors的三维定量构效关系(3D-QSAR),利用比较分子场分析和比较分子相似性指数分析方法建立了具有良好预测能力的模型。通过分子静电势分析、分子对接和分子动力学模拟等计算手段提出了PMH inhibitors可能的抑制机理,为LpxC靶向的分子设计提供了理论依据。

方法

分子对接

三维定量构效关系(3D-QSAR)

分子动力学模拟

主要研究结果

对广谱LpxC Inhibitors吡啶酮甲基砜异羟肟酸(PMH)进行了分子模拟研究,以研究其化学结构与生物活性之间的关系。 用CoMFA和CoMSIA对PMH进行3D-QSAR研究,得到了具有良好预测能力的3D-QSAR模型。根据等高线图的结果,在PMH中引入大体积基团和吸电子基团可以有效地提高活性。 基于对PMH的分子静电势的分析,在分子水平上解释了取代基对活性的影响。

PaLpxC和PaLpxC-Cmpd#290进行120ns的分子动力学模拟比较。基于MD轨迹的结合自由能计算结果表明,结合自由能计算结果与实验值吻合良好,范德华相互作用是复合物形成的主要驱动力。 H键和能量分解的结果表明,Cmpd#290主要与PaLpxC的残基M62,T190,F191,H264,I197和K238相互作用。

最后,通过轨迹采样分析研究了PaLpxC中关键水分子的结合模式。 没有任何限制,水分子可以自由进入PaLpxC的活性口袋; 在残基E77,H264,T190和M62的辅助下,它可以与Zn2 +配位形成四面体结构(O-Zn的平均长度约为2.27),为水解反应提供恒定的试剂。 复合物结构中,Cmpd#290通过异羟肟酸部分螯合Zn2 +,导致水分子结合模式的破坏。 通过其疏水链封闭袋进一步阻止反应底物的进入,从而发挥抑制作用。 这项工作为针对PaLpxC的Inhibitor分子设计提供了理论指导。


2018年8月14日/通过: wyd
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/08/6-2.jpg 392 900 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png wyd2018-08-14 14:22:142021-06-03 17:07:28PMH与LpxC的分子识别及3D-QSAR模型

抗菌酶LpxC与小分子的作用机理研究

成功案例

背景

内毒素脂质A(lipid A,LA)作为G-菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)嵌合于外膜上的“ 锚”, 其生物合成对于G-菌外膜组装至关重要。LA的合成共有9个酶参与, 其中由LpxC基因编码的UDP-3-O-(R-羟基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶(LpxC)催化的脱乙酰反应是整个生物合成途径中的首个关键步骤,有效抑制LpxC能干扰LPS的合成,最终导致菌体细胞的死亡。另外, LpxC在G-菌中高度保守(超过40种),且在人和哺乳动物体内无同源性蛋白质。因此, LpxC是理想的抗菌药物新靶点,基于LpxC结构开发小分子Inhibitor或将改善耐药G-菌感染治疗困难的现状。

目的

通过同源模建(homology modeling)技术、分子对接(molecular docking)和分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟等方法构建合理的AbLpxC结构,并从氢键和结合自由能等角度出发讨论典型LpxC Inhibitor与其的分子识别机制。

方法

同源模建

分子对接

分子动力学模拟

主要研究结果

基于PaLpxC晶体结构, 通过同源模建技术模建了AbLpxC全酶模型, 并将最低PDF和DOPE值的构象作为最终模建结果。通过Ramachandran plot和Profile-3D参数验证了模型的可靠性。

模建模型的97.3%位于最适区, 2.4%位于允许区, 仅A255残基位于禁止区。 随后采用MD模拟精修了AbLpxC模型, 势能、回转半径和RMSD值分析结果表明, 部分不合理的构象得到有效修正且整个模拟轨迹较为平稳。最后, 基于MD模拟平衡后能量最低构象与文献报道的12个BOAHAs抑制剂进行了分子对接,对接结果显示,C1为AbLpxC模型的最佳抑制剂, 其四氢呋喃环为影响分子识别的关键结构. 疏水链的长度对BOAHAs Inhibitor活性影响较大。

另外, 单手性结构中仅S构型能有效结合于F191,H237和K238组成的口袋,解释了R和S构型间结合自由能的差异,且与抑制活性实验测定结果吻合. 本文将为基于AbLpxC结构的新抗菌分子筛选、设计提供有用的结构信息。

2018年8月13日/通过: wyd
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/08/5-4.jpg 496 545 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png wyd2018-08-13 17:18:402021-06-03 17:14:17抗菌酶LpxC与小分子的作用机理研究

HCV NS3/4A 蛋白酶与FAM的识别及分子设计基础研究

成功案例

背景

HCV NS3/4A 蛋白酶 (Protease,PR) 是由NS3丝氨酸蛋白与辅助因子NS4A 蛋白以非共价键结合而成的二聚体。NS3 丝氨酸PR 是HCV非结构蛋白加工成熟过程的关键酶,与三磷酸核苷酸酶、RNA 解螺旋酶结合,构成HCV 复制所必需的非结构蛋白NS3。NS3 属于胰PR 超家族,拥有PR 和RNA 解螺旋酶双重活性,位于由HCV RNA 编码的前体多聚蛋白的开放阅读框 (Open reading frame,ORF) 中的非结构蛋白区中。另外,NS3/4A PR 能水解TRIF 和MAVS 两种人类免疫蛋白,从而干扰人体对HCV 的先天性免疫应答。NS3/4A PR 还可通过调控IFN-3 的表达水平,破坏细胞内免疫通路,诱导宿主产生免疫逃逸。

Faldaprevir 类似物分子 (Faldaprevir analogue molecule ,FAM)作为一种HCVNS3/4A PR Inhibitor,能有效抑制NS3/4A PR 活性。阻断HCV 的复制、翻译和翻译后多聚蛋白的加工成熟,还可使IFN 更好地发挥疗效。

目的

用分子动力学 (Molecular dynamics,MD) 模拟方法对HCV NS3/4A 蛋白酶与Faldaprevir 类似物的分子识别机制及其复合物运动模式进行了研究,为后续的结构改造提供结构及理论支撑。

方法

分子动力学模拟(Amber)

能量分解(MM/GBSA)

主要研究结果

对HCV NS3/4A 蛋白酶与底物FAM 的复合物进行20.4 ns 的显含水分子动力学模拟。基于RMSF 计算值找出了分子的柔性区域,并与实验B 因子值进行了相关性分析,良好的相关性验证了模拟方法的可靠性。FAM 的取代尿素侧链上的NH 与蛋白酶A157,以及乙烯基侧链的O 与S139 形成较为稳定的氢键。

结合自由能计算值与类似化合物的实验值吻合较好,其中范德华相互作用为复合物形成的主要驱动力。通过能量分解分析发现,FAM 的双分子结合模式为发挥效果关键形式,V55 在形成复合物的关键残基,对现有实验数据做了有益补充。随后的突变实验也证明了V55、I153 和F154 对FAM 识别重要作用。

最后,对复合物体系的构象变化做了简要分析,得到了模拟过程中的4类代表性稳定构象。模拟结果为以HCV NS3/4A蛋白酶的分子设计和分子的作用机理研究提供了一定的理论指导。

2018年8月13日/通过: wyd
https://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/08/4-5.jpg 748 905 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2022/05/MD-logo-300x129.png wyd2018-08-13 16:54:402019-07-10 10:59:59HCV NS3/4A 蛋白酶与FAM的识别及分子设计基础研究
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