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短链脱氢酶催化合成奥利司他中间体的机制研究

成功案例

合作单位:Zhejiang Ocean University

参考文献:Yuping Tang, Yafeng Zhou, Qiaojun Zhao, et al.. Process Biochemistry, 2020. DOI: 10.1016/j.procbio.2020.02.015 (IF = 3.06)

本文首次报道采用生物酶法通过MOT来制备奥利司他中间体(R)-MHOT,该研究成果为奥利司他的绿色合成奠定了基础。

背景:

奥利司他(Orlistat)是一种有效的,特异性的,长效胃肠道脂肪酶抑制剂,可以通过抑制脂肪酶来减少饮食中脂肪的吸收,进而减轻体重。目前,奥利司他的获得途径主要分两种:以天然产物利普斯他汀(Lipstatin)为起始物进行结构修饰得到;或者采用天然产物全合成方法。然而,利普斯他汀难以提取,导致患者难以负担昂贵的医药费用。而全合成方法可以减少花费,是目前制备奥利司他的主要方法。

(R)-MHOT是合成奥利司他过程中非常关键的中间体,目前获得(R)-MHOT的方法主要有化学合成和生物合成两种。化学方法由于ee值低,花费高等缺点难以大规模生产,因此生物合成方法是目前最具前景的合成方法。

近年来,还原酶在手性化合物的合成中发挥着重要的作用,大量的手性化合物都可以采用还原酶来合成。然而目前还没有还原酶不对称还原MOT产生(R)-MHOT的相关报道。本文根据之前研究的成果,采用NaSDR-G145A/I199L酶催化还原MOT产生(R)-MHOT,产量达到50 g/L。并采用分子模拟方法对该酶与MOT的结合模式及突变体产率增加的机制进行了深入研究。

方案设计:

作者先构建得到NaSDR及G145A/I199L突变体重组蛋白,并在不同温度,pH等条件下测试酶对MOT的催化效率。最后采用分子模拟方法,研究了酶及突变体与MOT的最适催化构象,并解释了突变体产率增加的原因。

主要结果:

在非线性回归的分析基础上,NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的Km值分别为0.08和0.11 mM,而野生型和突变体的kcat值分别为0.90/s和2.91/s,突变之后该酶的催化效率提高了3倍以上。

表1 NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化的动力学参数

通过测试不同pH和不同实验温度对酶活性的影响,发现在pH=7和35℃附近,该酶具有较好的催化能力,如下图所示。

图1 pH(a)和温度(b)对NaSDR-G145A/I199L活性的影响

最后,本文采用分子对接方法研究了NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的最佳构象进行了研究。首先采用同源模建方法得到蛋白的三维结构并进行合理性评估。再将MOT分别对接到NaSDR和NaSDR-G145A/I199L的催化活性位点,结果如图2所示。从图中可以看出,MOT主要可以结合在蛋白的疏水空腔中,与辅酶NADH具有较近的距离,适合催化反应的发生。

图2 蛋白结构评估的拉氏图(a)和ERRAT值分布(b),MOT在NaSDR(c)和NaSDR-G145A/I199L(d)活性位点的结合模式

为了进一步研究突变前后MOT与蛋白的结合差异以及引起催化效率变化的主要原因,图3分析了MOT与周围氨基酸残基的相互作用情况。从图中可以看出,MOT主要结合在由Ile89, Val144, Met195, Leu196, Val214, Phe260 和NADH组成的疏水性口袋中。Ser143和Tyr156可以作为氢键供体与MOT形成氢键相互作用。而突变体中,Gly145突变为Ala145,Ile199突变为Leu199,可以进一步增强活性位点的疏水性质,进而增强MOT与突变体的结合能(由-5.02增加到-5.61 kcal/mol)。并且在突变之后,MOT中的羰基碳原子与NADH的催化距离由3.00 Å减小到2.73 Å,进一步证明了突变之后更有利于MOT的催化反应。

图3 MOT与NaSDR(a)和NaSDR-G145A/I199L(b)活性位点氨基酸残基的相互作用,MOT在突变前后关键的催化距离变化(c)

总的来讲,本文通过实验证明了NaSDR-G145A/I199L在35℃、中性条件下催化MOT产生(R)-MHOT的产量达到了50g/L,并通过分子模拟方法从原子层面解释了突变体产量提升的可能原因。定点突变或定向进化技术可以进一步提高该酶的催化能力,并用于大规模制备中间体(R)-MHOT。

2020年4月8日/0 评论/通过: wyd
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2020/04/图片-11.png 618 554 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png wyd2020-04-08 15:54:252020-04-08 16:38:14短链脱氢酶催化合成奥利司他中间体的机制研究

一种新型N-酰基高丝氨酸内酯合酶底物特异性结构研究

成功案例

合作单位:Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province

参考文献:L Jin, XJ Zhang, H Shi, W Wang, ZH Qiao, WG Yang, and WY Du. J. Agric. Food Chem., 2020, 68(8): 2516-2527. DOI: 10.1021/acs.jafc.9b07833 (IF = 3.80 一区top期刊)

在革兰氏阴性细菌嗜水气单胞菌中,N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)介导的群体感应(QS)影响致病性,蛋白质分泌和运动性。本文从分离的嗜水气单胞菌HX-3中克隆了AhyI基因,并首次证实该蛋白可以催化产生六种类型的AHL,而不是常规认为的两种。

背景:

嗜水气单胞菌(A. hydrophila)是一种革兰氏阴性菌,被称为人和动物的机会致病菌。A. hydrophila在水产养殖环境中无处不在,并导致鱼类,虾和蟹的疾病。食用受污染的水生动物后,人类可能会感染并发展为败血症,肠胃炎,骨髓炎和腹膜炎等。因此,近年来亲水型链球菌对食品安全的重要性已经成为人们广泛关注的问题。迄今为止,三种典型的亲水性在嗜水气单胞菌中已经发现了自动诱导物(AI)系统,包括基于AHL的自动诱导物AI-1系统,依赖S-核糖基同型半胱氨酸酶(LuxS)的自动诱导物AI-2系统,以及基于QseB / QseC的自动诱导物AI -3系统。

AHL合酶LuxI催化的AHL生物合成机制已证明涉及酰基从酰化酰基载体蛋白(酰基-ACP)到S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)氨基的转移。涉及酰基-SAM中间体的酰基转移反应被认为是在羧化氧的内酯化形成AHL产物和S-甲基硫代腺苷(MTA)之前发生的。最近,LuxI的同系物,BjaI仅使用酰基辅酶A和SAM作为底物,通过特定的酰基SAM中间体进行内酯化形成AHL。有趣的是,BjaI的研究证明了乙酰辅酶A可以作为BjaI催化脂肪链底物产生AHL的因子,而不是酰基-ACP。AHL合成的独特机制表明,底物与其他LuxI合成酶的作用截然不同。 迄今为止,尚未报道在AHL合酶反应过程中具有结合的底物的AhyI的详细结构,尽管已鉴定出完整的氨基酸序列和AhyI的保守残基,但各个氨基酸残基的作用仍不清楚。本研究中,将嗜水链球菌HX-3的AhyI基因克隆到大肠杆菌中,并通过系统发育分析和多序列比对鉴定评估AhyI酶。同时采用分子模拟方法研究了AhyI-C4ACP-SAM和AhyI-C12/14ACP复合物的分子结构,并对该酶的催化机制进行了探讨。

方案设计:

作者先从嗜水链球菌HX-3中分理处AhyI基因,并克隆到大肠杆菌中,通过UPLC-MS / MS方法分析鉴定出由AhyI催化产生的6种AHL。但AhyI与不同底物的结合模式,以及催化产生不同AHL的作用机制尚不清楚,因此魔德科技采用分子模拟方法对AhyI与底物之间的分子识别机制展开了深入研究。

主要结果:

本文采用UPLC-MS / MS方法从链球菌和大肠杆菌中分离鉴定出6种不同的AHL产物,如图所示。

图1 AHL的质谱分析,由6种AHL标准品(a),嗜水链球菌HX-3(b)和大肠杆菌中重组AhyI蛋白(c)产生的总离子电流UPLC-MS/MS色谱图。嗜水性链球菌(d)和大肠杆菌(e)中鉴定出的不同AHL的相对百分比。

由于目前AhyI的晶体结构尚未解析出来,因此本文首先采用同源模建方法构建了AhyI蛋白的空间结构,然后采用Autodock 4.2.6程序将底物对接到AhyI蛋白的活性位点中,筛选得到合理的复合物结合构象。

结果表明,底物C4-ACP的脂肪链主要结合在AhyI蛋白中较深的疏水性口袋中(由疏水性氨基酸Ile67,Leu100,Leu103,Val144和Phe152组成),这些疏水性氨基酸提供的强疏水环境可以极大的增强底物脂肪链与蛋白的亲和力,并可以稳定底物构象,使其与SAM具有较好的催化距离。

图2 C4-ACP与AhyI蛋白活性位点的结合模式。A:C4-ACP和SAM在蛋白表面的结合模式,蓝色和橙色分别表示亲水和疏水性区域;b:底物与活性位点附近氨基酸的相互作用情况;c:底物在AhyI中的结合位置,紫色和青色分别表示α螺旋和β折叠;d:AhyI中相关氨基酸残基与C4-ACP的立体视图。

最近,Shin等人发现具有较短脂肪链的底物可能会结合在同源蛋白RhlI的激活口袋附近,而长链的底物分子可能结合在附近的抑制口袋中,因为抑制口袋具有更大的空间,并且具有较多的疏水性氨基酸残基。为了进一步研究AhyI能够催化长链底物的主要原因,本文将C12-ACP和C14-ACP分别与AhyI蛋白对接,结果如下图所示。值得注意的是,两个长链底物的非极性脂肪链占据了相同的口袋,该口袋与RhlI的抑制口袋位置一致。口袋的内部主要有大量的疏水性氨基酸组成。并且,AhyI与长链底物的结合模式中,Phe125和Phe152形成了一个“夹子”,可以固定住C12-ACP和C14-ACP尾部的甲基基团,这与同源蛋白RhlI中的Leu124-Val35和AiiA lactonase中的Phe64-Phe68非常相似。

图3 AhyI长酰基链特异性结合口袋与C12-ACP(a)和C14-ACP(b)的结合模式。

尽管本研究中提供的蛋白-底物复合物模型不足以更加深入理解AhyI的催化机理,但是可以合理地假设这些酶具有相似的机理,因为这些LuxI同源蛋白之间存在结构相似性。 尽管关于AhyI的这一假设仍有待证明,但我们对AhyI的结构功能将在未来展开更加深入的研究,并提供其催化机制的相关信息。

2020年4月7日/0 评论/通过: wyd
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2020/04/1996-1.png 601 897 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png wyd2020-04-07 17:41:382020-04-07 17:41:39一种新型N-酰基高丝氨酸内酯合酶底物特异性结构研究

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