四川魔德科技有限公司
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短链脱氢酶催化合成奥利司他中间体的机制研究

成功案例

合作单位:Zhejiang Ocean University

参考文献:Yuping Tang, Yafeng Zhou, Qiaojun Zhao, et al.. Process Biochemistry, 2020. DOI: 10.1016/j.procbio.2020.02.015 (IF = 3.06)

本文首次报道采用生物酶法通过MOT来制备奥利司他中间体(R)-MHOT,该研究成果为奥利司他的绿色合成奠定了基础。

背景:

奥利司他(Orlistat)是一种有效的,特异性的,长效胃肠道脂肪酶抑制剂,可以通过抑制脂肪酶来减少饮食中脂肪的吸收,进而减轻体重。目前,奥利司他的获得途径主要分两种:以天然产物利普斯他汀(Lipstatin)为起始物进行结构修饰得到;或者采用天然产物全合成方法。然而,利普斯他汀难以提取,导致患者难以负担昂贵的医药费用。而全合成方法可以减少花费,是目前制备奥利司他的主要方法。

(R)-MHOT是合成奥利司他过程中非常关键的中间体,目前获得(R)-MHOT的方法主要有化学合成和生物合成两种。化学方法由于ee值低,花费高等缺点难以大规模生产,因此生物合成方法是目前最具前景的合成方法。

近年来,还原酶在手性化合物的合成中发挥着重要的作用,大量的手性化合物都可以采用还原酶来合成。然而目前还没有还原酶不对称还原MOT产生(R)-MHOT的相关报道。本文根据之前研究的成果,采用NaSDR-G145A/I199L酶催化还原MOT产生(R)-MHOT,产量达到50 g/L。并采用分子模拟方法对该酶与MOT的结合模式及突变体产率增加的机制进行了深入研究。

方案设计:

作者先构建得到NaSDR及G145A/I199L突变体重组蛋白,并在不同温度,pH等条件下测试酶对MOT的催化效率。最后采用分子模拟方法,研究了酶及突变体与MOT的最适催化构象,并解释了突变体产率增加的原因。

主要结果:

在非线性回归的分析基础上,NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的Km值分别为0.08和0.11 mM,而野生型和突变体的kcat值分别为0.90/s和2.91/s,突变之后该酶的催化效率提高了3倍以上。

表1 NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化的动力学参数

通过测试不同pH和不同实验温度对酶活性的影响,发现在pH=7和35℃附近,该酶具有较好的催化能力,如下图所示。

图1 pH(a)和温度(b)对NaSDR-G145A/I199L活性的影响

最后,本文采用分子对接方法研究了NaSDR和NaSDR-G145A/I199L催化MOT的最佳构象进行了研究。首先采用同源模建方法得到蛋白的三维结构并进行合理性评估。再将MOT分别对接到NaSDR和NaSDR-G145A/I199L的催化活性位点,结果如图2所示。从图中可以看出,MOT主要可以结合在蛋白的疏水空腔中,与辅酶NADH具有较近的距离,适合催化反应的发生。

图2 蛋白结构评估的拉氏图(a)和ERRAT值分布(b),MOT在NaSDR(c)和NaSDR-G145A/I199L(d)活性位点的结合模式

为了进一步研究突变前后MOT与蛋白的结合差异以及引起催化效率变化的主要原因,图3分析了MOT与周围氨基酸残基的相互作用情况。从图中可以看出,MOT主要结合在由Ile89, Val144, Met195, Leu196, Val214, Phe260 和NADH组成的疏水性口袋中。Ser143和Tyr156可以作为氢键供体与MOT形成氢键相互作用。而突变体中,Gly145突变为Ala145,Ile199突变为Leu199,可以进一步增强活性位点的疏水性质,进而增强MOT与突变体的结合能(由-5.02增加到-5.61 kcal/mol)。并且在突变之后,MOT中的羰基碳原子与NADH的催化距离由3.00 Å减小到2.73 Å,进一步证明了突变之后更有利于MOT的催化反应。

图3 MOT与NaSDR(a)和NaSDR-G145A/I199L(b)活性位点氨基酸残基的相互作用,MOT在突变前后关键的催化距离变化(c)

总的来讲,本文通过实验证明了NaSDR-G145A/I199L在35℃、中性条件下催化MOT产生(R)-MHOT的产量达到了50g/L,并通过分子模拟方法从原子层面解释了突变体产量提升的可能原因。定点突变或定向进化技术可以进一步提高该酶的催化能力,并用于大规模制备中间体(R)-MHOT。

2020年4月8日/0 评论/通过: wyd
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2020/04/图片-11.png 618 554 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png wyd2020-04-08 15:54:252020-04-08 16:38:14短链脱氢酶催化合成奥利司他中间体的机制研究

一种新型N-酰基高丝氨酸内酯合酶底物特异性结构研究

成功案例

合作单位:Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province

参考文献:L Jin, XJ Zhang, H Shi, W Wang, ZH Qiao, WG Yang, and WY Du. J. Agric. Food Chem., 2020, 68(8): 2516-2527. DOI: 10.1021/acs.jafc.9b07833 (IF = 3.80 一区top期刊)

在革兰氏阴性细菌嗜水气单胞菌中,N-酰基高丝氨酸内酯(AHL)介导的群体感应(QS)影响致病性,蛋白质分泌和运动性。本文从分离的嗜水气单胞菌HX-3中克隆了AhyI基因,并首次证实该蛋白可以催化产生六种类型的AHL,而不是常规认为的两种。

背景:

嗜水气单胞菌(A. hydrophila)是一种革兰氏阴性菌,被称为人和动物的机会致病菌。A. hydrophila在水产养殖环境中无处不在,并导致鱼类,虾和蟹的疾病。食用受污染的水生动物后,人类可能会感染并发展为败血症,肠胃炎,骨髓炎和腹膜炎等。因此,近年来亲水型链球菌对食品安全的重要性已经成为人们广泛关注的问题。迄今为止,三种典型的亲水性在嗜水气单胞菌中已经发现了自动诱导物(AI)系统,包括基于AHL的自动诱导物AI-1系统,依赖S-核糖基同型半胱氨酸酶(LuxS)的自动诱导物AI-2系统,以及基于QseB / QseC的自动诱导物AI -3系统。

AHL合酶LuxI催化的AHL生物合成机制已证明涉及酰基从酰化酰基载体蛋白(酰基-ACP)到S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)氨基的转移。涉及酰基-SAM中间体的酰基转移反应被认为是在羧化氧的内酯化形成AHL产物和S-甲基硫代腺苷(MTA)之前发生的。最近,LuxI的同系物,BjaI仅使用酰基辅酶A和SAM作为底物,通过特定的酰基SAM中间体进行内酯化形成AHL。有趣的是,BjaI的研究证明了乙酰辅酶A可以作为BjaI催化脂肪链底物产生AHL的因子,而不是酰基-ACP。AHL合成的独特机制表明,底物与其他LuxI合成酶的作用截然不同。 迄今为止,尚未报道在AHL合酶反应过程中具有结合的底物的AhyI的详细结构,尽管已鉴定出完整的氨基酸序列和AhyI的保守残基,但各个氨基酸残基的作用仍不清楚。本研究中,将嗜水链球菌HX-3的AhyI基因克隆到大肠杆菌中,并通过系统发育分析和多序列比对鉴定评估AhyI酶。同时采用分子模拟方法研究了AhyI-C4ACP-SAM和AhyI-C12/14ACP复合物的分子结构,并对该酶的催化机制进行了探讨。

方案设计:

作者先从嗜水链球菌HX-3中分理处AhyI基因,并克隆到大肠杆菌中,通过UPLC-MS / MS方法分析鉴定出由AhyI催化产生的6种AHL。但AhyI与不同底物的结合模式,以及催化产生不同AHL的作用机制尚不清楚,因此魔德科技采用分子模拟方法对AhyI与底物之间的分子识别机制展开了深入研究。

主要结果:

本文采用UPLC-MS / MS方法从链球菌和大肠杆菌中分离鉴定出6种不同的AHL产物,如图所示。

图1 AHL的质谱分析,由6种AHL标准品(a),嗜水链球菌HX-3(b)和大肠杆菌中重组AhyI蛋白(c)产生的总离子电流UPLC-MS/MS色谱图。嗜水性链球菌(d)和大肠杆菌(e)中鉴定出的不同AHL的相对百分比。

由于目前AhyI的晶体结构尚未解析出来,因此本文首先采用同源模建方法构建了AhyI蛋白的空间结构,然后采用Autodock 4.2.6程序将底物对接到AhyI蛋白的活性位点中,筛选得到合理的复合物结合构象。

结果表明,底物C4-ACP的脂肪链主要结合在AhyI蛋白中较深的疏水性口袋中(由疏水性氨基酸Ile67,Leu100,Leu103,Val144和Phe152组成),这些疏水性氨基酸提供的强疏水环境可以极大的增强底物脂肪链与蛋白的亲和力,并可以稳定底物构象,使其与SAM具有较好的催化距离。

图2 C4-ACP与AhyI蛋白活性位点的结合模式。A:C4-ACP和SAM在蛋白表面的结合模式,蓝色和橙色分别表示亲水和疏水性区域;b:底物与活性位点附近氨基酸的相互作用情况;c:底物在AhyI中的结合位置,紫色和青色分别表示α螺旋和β折叠;d:AhyI中相关氨基酸残基与C4-ACP的立体视图。

最近,Shin等人发现具有较短脂肪链的底物可能会结合在同源蛋白RhlI的激活口袋附近,而长链的底物分子可能结合在附近的抑制口袋中,因为抑制口袋具有更大的空间,并且具有较多的疏水性氨基酸残基。为了进一步研究AhyI能够催化长链底物的主要原因,本文将C12-ACP和C14-ACP分别与AhyI蛋白对接,结果如下图所示。值得注意的是,两个长链底物的非极性脂肪链占据了相同的口袋,该口袋与RhlI的抑制口袋位置一致。口袋的内部主要有大量的疏水性氨基酸组成。并且,AhyI与长链底物的结合模式中,Phe125和Phe152形成了一个“夹子”,可以固定住C12-ACP和C14-ACP尾部的甲基基团,这与同源蛋白RhlI中的Leu124-Val35和AiiA lactonase中的Phe64-Phe68非常相似。

图3 AhyI长酰基链特异性结合口袋与C12-ACP(a)和C14-ACP(b)的结合模式。

尽管本研究中提供的蛋白-底物复合物模型不足以更加深入理解AhyI的催化机理,但是可以合理地假设这些酶具有相似的机理,因为这些LuxI同源蛋白之间存在结构相似性。 尽管关于AhyI的这一假设仍有待证明,但我们对AhyI的结构功能将在未来展开更加深入的研究,并提供其催化机制的相关信息。

2020年4月7日/0 评论/通过: wyd
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2020/04/1996-1.png 601 897 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png wyd2020-04-07 17:41:382020-04-07 17:41:39一种新型N-酰基高丝氨酸内酯合酶底物特异性结构研究

分子模拟在荧光传感平台中的应用——主客体相互作用研究

成功案例

合作单位:Yangtze Normal University

参考文献:Xiaoping, Tan, Yang, et al.. Sensors, 2018. DOI: 10.3390/s18113927 (IF = 3.72)

本文首次采用竞争性主客体识别方法,研究了阳离子柱[5]芳烃(CP5)与左旋肉碱的相互作用与传感机制。并利用CP5功能化的金纳米粒子构建了荧光传感平台(CP5@Au-NPs)作为受体,以对左旋肉碱具有高度敏感性和选择性的罗丹明123作为探针。该荧光传感平台可以用来检测人血清和牛奶中的左旋肉碱,为及时发现药物滥用并解决食品安全问题提供了指导。

图1 罗丹明123、左旋肉碱和CP5的结构,荧光传感平台CP5@Au-NPs检测左旋肉碱的作用机制

背景:

金纳米材料Au-NPs具有易合成,化学稳定性高,容易表面功能化修饰等优点,因此引起了纳米技术和纳米材料领域研究人员的极大兴趣,金纳米材料的应用非常广泛,包括生物医药,传感器,催化和纳米电子学等。金纳米粒子与表面配体的相互作用也是许多应用的关键问题,例如,适当地改变纳米粒子表面的性质可以大大提高其传感器的电位。

大环芳烃在超分子化学方面具有非常重要的作用,柱芳烃是继冠醚,杯芳烃,环糊精和瓜环后,第五代大环主体分子,由Ogoshi等人在2008年首次报道。柱芳烃主要包括柱5芳烃和柱6芳烃,均由亚甲基桥连接,形成独特的刚性支柱结构。虽然目前对于柱芳烃的研究较多,但其与金纳米材料的结合以及所得杂化纳米材料的应用仍然鲜有报道。

左旋肉碱是一种天然物质,在人体脂肪酸氧化及能量的产生过程中具有关键的作用,缺乏该种物质会导致毒性的游离脂肪酸累积。因此目前有很多检测左旋肉碱的方法,比如色谱法,毛细管电泳,伏安法和荧光法等。但是目前仍然需要一种高灵敏性的工具来检测左旋肉碱。

本文主要描述了一种简单便捷的在柱[5]芳烃和左旋肉碱之间的“开关”式荧光传感平台,该平台以CP5@Au-NPs作为受体,罗丹明123作为探针分子,罗丹明对左旋肉碱具有较强的选择性和敏感性。

方案设计:

作者先构建出CP5@Au-NPs荧光传感平台,并经过荧光测试具有较好的检测左旋肉碱的效果。但CP5与左旋肉碱之间的识别模式以及二者结合的驱动力尚不清楚,因此魔德科技采用分子模拟方法对主客体之间的结合模式进行了分子层面的研究。

主要结果:

从图中可以看出R123的荧光强度在CP5@Au-NPs体系中出现了明显的淬灭现象,并且随着CP5@Au-NPs的浓度不断增加,罗丹明123的荧光强度不断降低,因此,R123可以依靠主客体相互作用与CP5结合。而当加入左旋肉碱之后,罗丹明123的荧光强度发生了逆转,逐渐增强。总的来讲,罗丹明123可以进入CP5的空腔中与其结合,并在加入左旋肉碱之后,由于竞争性的作用,左旋肉碱可以与CP5结合,并导致罗丹明的结合减弱。因此,这是一种“开关”模式。

图2 A:在10 μM的CP5和16 μM的CP5@Au-NPs存在下,罗丹明123的荧光强度;B:不同CP5@Au-NPs浓度对罗丹明123荧光淬灭的影响;C:不同浓度左旋肉碱对R123@CP5@Au-NPs复合材料荧光光谱的影响;D:R123@CP5@Au-NPs与左旋肉碱浓度荧光强度的校准曲线。

本文采用了分子对接方法研究了CP5与左旋肉碱之间的识别模式。分子对接采用AutoDock 4.2.6软件包,由于CP5的空腔大小和左旋肉碱的分子大小,二者采用1:1的结合模式。从图中可以看出,左旋肉碱结构中带负电荷的羧基可以与CP5结构中带正电荷的N原子形成较强的静电吸引作用。而左旋肉碱的带正电荷的季氨基可以与CP5的苯环形成cation-π相互作用。

图3 CP5与左旋肉碱的分子对接结合模式。A和B分别为俯视图和主视图;C和D分别为静电和疏水相互作用模式。

最后,本文采用1H-NMR方法对CP5与左旋肉碱的分子识别机制进行了研究。从图中可以看出左旋肉碱中的Ha和Hb质子的光谱在结合CP5之后消失了。由此可以证明CP5能够有效识别左旋肉碱分子并释放罗丹明123。

图4 1H-NMR光谱分析(a:左旋肉碱;b:CP5+左旋肉碱;c:CP5)

2020年4月7日/通过: wyd
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2020/04/图片-2.png 435 479 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png wyd2020-04-07 11:01:132020-04-07 15:37:09分子模拟在荧光传感平台中的应用——主客体相互作用研究

分子自组装(self-assembly)

成功案例
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2019年4月23日/0 评论/通过: wyd
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2019/04/self-assembly.png 483 550 wyd http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png wyd2019-04-23 08:58:542019-06-14 15:22:33分子自组装(self-assembly)

PMH与LpxC的分子识别及3D-QSAR模型

成功案例

背景

内毒素脂质A(LA)的合成共有9个酶参与, 其中由LpxC基因编码的UDP-3-O-(R-羟基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶(LpxC)催化的脱乙酰反应是整个生物合成途径中的首个关键步骤,有效抑制LpxC能干扰LPS的合成,最终导致菌体细胞的死亡。另外, LpxC在G-菌中高度保守(超过40种),且在人和哺乳动物体内无同源性蛋白质。因此, LpxC是理想的抗菌酶Target,基于LpxC结构开发小分子将改善G-菌感染治疗困难的现状。

LpxC为一种锌离子依赖性金属酶,呈“ β-α-α-β”夹层结构, 由2个具有相似拓扑学结构的结构域(Domain Ⅰ和Domain Ⅱ)组成。 每个结构域分别含有1个独特的插入区(Insert Ⅰ和Insert Ⅱ)。插入区Ⅰ界定了活性位点的范围,并固定了具有催化活性的锌离子。基于该酶特殊的结构,近年来有多类分子相继被报道,大部分Inhibitors都含有能与锌离子结合、抑制其催化活性的基团和较长的疏水链,以适应酶的疏水通道。

本项工作中首先整合现有数据库ChEMBL 的文献报告,建立LpxC Inhibitors的虚拟库,然后选择38种PMH化合物和活性数据建立三维定量构效关系(3D-QSAR)模型。通过分子动力学模拟探索PMH LpxC Inhibitors可能的作用机制,为PMH LpxC Inhibitors的活性预测,分子设计和修饰提供理论依据。

目的

通过研究PMH inhibitors的三维定量构效关系(3D-QSAR),利用比较分子场分析和比较分子相似性指数分析方法建立了具有良好预测能力的模型。通过分子静电势分析、分子对接和分子动力学模拟等计算手段提出了PMH inhibitors可能的抑制机理,为LpxC靶向的分子设计提供了理论依据。

方法

分子对接

三维定量构效关系(3D-QSAR)

分子动力学模拟

主要研究结果

对广谱LpxC Inhibitors吡啶酮甲基砜异羟肟酸(PMH)进行了分子模拟研究,以研究其化学结构与生物活性之间的关系。 用CoMFA和CoMSIA对PMH进行3D-QSAR研究,得到了具有良好预测能力的3D-QSAR模型。根据等高线图的结果,在PMH中引入大体积基团和吸电子基团可以有效地提高活性。 基于对PMH的分子静电势的分析,在分子水平上解释了取代基对活性的影响。

PaLpxC和PaLpxC-Cmpd#290进行120ns的分子动力学模拟比较。基于MD轨迹的结合自由能计算结果表明,结合自由能计算结果与实验值吻合良好,范德华相互作用是复合物形成的主要驱动力。 H键和能量分解的结果表明,Cmpd#290主要与PaLpxC的残基M62,T190,F191,H264,I197和K238相互作用。

最后,通过轨迹采样分析研究了PaLpxC中关键水分子的结合模式。 没有任何限制,水分子可以自由进入PaLpxC的活性口袋; 在残基E77,H264,T190和M62的辅助下,它可以与Zn2 +配位形成四面体结构(O-Zn的平均长度约为2.27),为水解反应提供恒定的试剂。 复合物结构中,Cmpd#290通过异羟肟酸部分螯合Zn2 +,导致水分子结合模式的破坏。 通过其疏水链封闭袋进一步阻止反应底物的进入,从而发挥抑制作用。 这项工作为针对PaLpxC的Inhibitor分子设计提供了理论指导。


2018年8月14日/0 评论/通过: jmwang
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/08/6-2.jpg 392 900 jmwang http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png jmwang2018-08-14 14:22:142019-07-10 11:10:54PMH与LpxC的分子识别及3D-QSAR模型

抗菌酶LpxC与小分子的作用机理研究

成功案例

背景

内毒素脂质A(lipid A,LA)作为G-菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)嵌合于外膜上的“ 锚”, 其生物合成对于G-菌外膜组装至关重要。LA的合成共有9个酶参与, 其中由LpxC基因编码的UDP-3-O-(R-羟基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶(LpxC)催化的脱乙酰反应是整个生物合成途径中的首个关键步骤,有效抑制LpxC能干扰LPS的合成,最终导致菌体细胞的死亡。另外, LpxC在G-菌中高度保守(超过40种),且在人和哺乳动物体内无同源性蛋白质。因此, LpxC是理想的抗菌药物新靶点,基于LpxC结构开发小分子Inhibitor或将改善耐药G-菌感染治疗困难的现状。

目的

通过同源模建(homology modeling)技术、分子对接(molecular docking)和分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟等方法构建合理的AbLpxC结构,并从氢键和结合自由能等角度出发讨论典型LpxC Inhibitor与其的分子识别机制。

方法

同源模建

分子对接

分子动力学模拟

主要研究结果

基于PaLpxC晶体结构, 通过同源模建技术模建了AbLpxC全酶模型, 并将最低PDF和DOPE值的构象作为最终模建结果。通过Ramachandran plot和Profile-3D参数验证了模型的可靠性。

模建模型的97.3%位于最适区, 2.4%位于允许区, 仅A255残基位于禁止区。 随后采用MD模拟精修了AbLpxC模型, 势能、回转半径和RMSD值分析结果表明, 部分不合理的构象得到有效修正且整个模拟轨迹较为平稳。最后, 基于MD模拟平衡后能量最低构象与文献报道的12个BOAHAs抑制剂进行了分子对接,对接结果显示,C1为AbLpxC模型的最佳抑制剂, 其四氢呋喃环为影响分子识别的关键结构. 疏水链的长度对BOAHAs Inhibitor活性影响较大。

另外, 单手性结构中仅S构型能有效结合于F191,H237和K238组成的口袋,解释了R和S构型间结合自由能的差异,且与抑制活性实验测定结果吻合. 本文将为基于AbLpxC结构的新抗菌分子筛选、设计提供有用的结构信息。

2018年8月13日/0 评论/通过: jmwang
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/08/5-4.jpg 496 545 jmwang http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png jmwang2018-08-13 17:18:402019-07-10 11:14:20抗菌酶LpxC与小分子的作用机理研究

HCV NS3/4A 蛋白酶与FAM的识别及分子设计基础研究

成功案例

背景

HCV NS3/4A 蛋白酶 (Protease,PR) 是由NS3丝氨酸蛋白与辅助因子NS4A 蛋白以非共价键结合而成的二聚体。NS3 丝氨酸PR 是HCV非结构蛋白加工成熟过程的关键酶,与三磷酸核苷酸酶、RNA 解螺旋酶结合,构成HCV 复制所必需的非结构蛋白NS3。NS3 属于胰PR 超家族,拥有PR 和RNA 解螺旋酶双重活性,位于由HCV RNA 编码的前体多聚蛋白的开放阅读框 (Open reading frame,ORF) 中的非结构蛋白区中。另外,NS3/4A PR 能水解TRIF 和MAVS 两种人类免疫蛋白,从而干扰人体对HCV 的先天性免疫应答。NS3/4A PR 还可通过调控IFN-3 的表达水平,破坏细胞内免疫通路,诱导宿主产生免疫逃逸。

Faldaprevir 类似物分子 (Faldaprevir analogue molecule ,FAM)作为一种HCVNS3/4A PR Inhibitor,能有效抑制NS3/4A PR 活性。阻断HCV 的复制、翻译和翻译后多聚蛋白的加工成熟,还可使IFN 更好地发挥疗效。

目的

用分子动力学 (Molecular dynamics,MD) 模拟方法对HCV NS3/4A 蛋白酶与Faldaprevir 类似物的分子识别机制及其复合物运动模式进行了研究,为后续的结构改造提供结构及理论支撑。

方法

分子动力学模拟(Amber)

能量分解(MM/GBSA)

主要研究结果

对HCV NS3/4A 蛋白酶与底物FAM 的复合物进行20.4 ns 的显含水分子动力学模拟。基于RMSF 计算值找出了分子的柔性区域,并与实验B 因子值进行了相关性分析,良好的相关性验证了模拟方法的可靠性。FAM 的取代尿素侧链上的NH 与蛋白酶A157,以及乙烯基侧链的O 与S139 形成较为稳定的氢键。

结合自由能计算值与类似化合物的实验值吻合较好,其中范德华相互作用为复合物形成的主要驱动力。通过能量分解分析发现,FAM 的双分子结合模式为发挥效果关键形式,V55 在形成复合物的关键残基,对现有实验数据做了有益补充。随后的突变实验也证明了V55、I153 和F154 对FAM 识别重要作用。

最后,对复合物体系的构象变化做了简要分析,得到了模拟过程中的4类代表性稳定构象。模拟结果为以HCV NS3/4A蛋白酶的分子设计和分子的作用机理研究提供了一定的理论指导。

2018年8月13日/0 评论/通过: jmwang
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/08/4-5.jpg 748 905 jmwang http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png jmwang2018-08-13 16:54:402019-07-10 10:59:59HCV NS3/4A 蛋白酶与FAM的识别及分子设计基础研究

泛素化途径中Skp2蛋白的作用机理研究

成功案例

背景

泛素依赖性降解途径( ubiquitin dependent degradation pathway,UDDP) 可降解细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子( cyclin dependent kinase inhibitor,CKI) ,其在癌细胞中的异常表达是癌细胞无限生长的主要原因之一. UDDP 中主要包含3 种酶: 泛素激活酶1( ubiquitin-activating enzyme,E1) 、泛素结合酶2 ( ubiquitin-conjugating enzyme,E2) 和泛素蛋白连接酶3 ( ubiquitin-protein ligase,E3) ,其中E3 与靶蛋白识别的过程是降解途径中的关键限速步骤. 包含F-box 蛋白的SCF( Skp1-Cullin 1-Fbox)型泛素蛋白连接酶E3 是其中重要的一种,受到广泛关注. 作为F-box 蛋白家族的成员之一,S期激酶相关蛋白2( S-phase kinase-associated protein2,Skp2) 与Skp1、Cul1、Rbxl 等因子组成E3 连接酶,参与催化细胞由G1 期到S 期的转变过程.其中Rbx1 通过Cul1 与Skp1 连接,具有激活该蛋白复合体的重要作用,而Skp2 则通过F-box 区域与Skp1 相连. Skp2 蛋白由424 个氨基酸组成,包含Fbox和亮氨酸重复区( leucine-rich repeats,LRR) 2 个重要的功能性区域。 其中,F-box 区域由43 个氨基酸组成,LRR 则主要包含10 个富含亮氨酸的重复序列,并可与底物CKI ( 如p27 等) 特异性识别。 因此,Skp2 蛋白作为一个新颖潜在的Target,受到越来越多研究人员的重视。

最近,Chan 等通过对大量化学数据库进行高通量筛选,发现苯并噻唑类分子( BPC) 对Skp2 E3 具有较高的活性。 体外实验还发现,小分子BPC 在多种动物模型中对细胞都有较好的效果,对应的IC50均小于5 μmol /L,可作为Skp2 开发中的先导分子。 不过,BPC 与Skp2 的结合模式、识别驱动力和结合前后的构象变化等重要的科学问题尚未见报道.

目的

采用同源模建、分子对接、分子动力学( molecular dynamics, MD) 模拟、成簇分析和自由能计算等方法对BPC与Skp2蛋白的分子识别及其作用机理进行探讨,为后续基于Skp2 结构的分子设计提供一定的帮助。

方法

同源模建

分子对接

分子动力学模拟

成簇分析

自由能计算

主要研究结果

用同源模建、分子对接方法构建Skp1-Skp2 及Skp1-Skp2-BPC 体系,基于2 个体系的50 ns 对比MD 模拟轨迹,研究了BPC 和Skp2 之间的相互作用,并给出了BPC 可能的抗癌抑制机制. 首先对Skp1 缺失的loop 进行补全,并通过PDF、Ramachandran 图和Profile-3D 等参数验证补全模型的可靠性。

BPC 与Skp1-Skp2 的分子对接结果表明: D110、R138 可以与BPC 中的二氢吡喃酮形成氢键. MD 模拟的RMSF 值与B 因子的显著相关性,证明动力学模拟及其柔性分析的可靠性. 氢键、能量分解及自由能计算结果表明,W109、D110、L117、I120、R138、W139 是Skp2 与BPC 识别的关键残基;疏水相互作用是驱使二者识别的主要驱动力; 自由能计算和关键残基计算结果与实验数据吻合较好.最后通过对比分析体系Skp1-Skp2 和Skp1-Skp2-BPC 的运动模式,BPC 的结合导致了Skp1 运动模式更为剧烈,并有脱离Skp2 的趋势,这可能是该Inhibitor发挥生物学功能的作用之一.


2018年8月13日/0 评论/通过: jmwang
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/08/5-3.jpg 625 683 jmwang http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png jmwang2018-08-13 16:13:572019-07-10 10:43:57泛素化途径中Skp2蛋白的作用机理研究

HIV IN与DKAs的分子模拟研究

成功案例

背景

目前,全球流行的主要是HIV-1 病毒。HIV-1 的基因可以编码3 种酶: 逆转录酶( reverse transcriptase, RT) 、整合酶( integrase, IN)和蛋白酶( protease, PR) 。其中IN 是一个由288 个氨基酸残基组成的蛋白,折叠成3 个结构域,分别是N 末端结构域( N-terminal domain, NTD) 、C 末端结构域( C-terminal domain, CTD) 和催化核心结构域( catalytic core domain, CCD) 。其中CCD 含有IN 催化活性所必需的,由D64、D116 和E152  三个酸性氨基酸残基所组成的基序( DDE 基序) ,该基序是高度保守的,任何一个发生突变都会破坏酶的活性,从而影响病毒的正常复制。IN 能介导逆转录病毒DNA 整合到宿主细胞DNA 上,整合过程包括两步反应: 第一步为3’端加工( 3′-processing,3′-P) 反应,在宿主细胞内, IN 切除HIV 病毒DNA 3’末端的2 个核苷酸,使末端碱基上的羟基暴露出来,为第二步反应做准备; 第二步是链转移( strandtransfer,ST) 反应,在细胞核内, IN 交错切割宿主细胞DNA,然后病毒DNA 的3’末端的羟基与宿主细胞DNA 的5’端通过共价键连接,形成一个整合后的新DNA,并随着宿主DNA 的复制而复制,进而完成HIV-1 的复制繁殖。

目的

研究二酮酸类分子(DKAs)与HIV-1整合酶(integrase, IN)的分子识别机制和二者复合物的构象变化。

方法

使用AutoDock程序包将10个二酮酸类分子与整合酶进行了分子对接,得到一系列对接复合物模型。选取其中两个活性有明显差异的复合物进行了15 ns的分子动力学模拟,从能量和氢键的角度分析了二者与HIV-1整合酶识别的关键残基。

工具

分子对接(AutoDock)

分子动力学(Amber)

主要研究结果

对10个DKAs与HIV-1 IN进行了分子对接,并将对接的结合自由能与lgIC50进行了相关性分析,结果发现,二者并没有显著相关性,此类分子的抑制活性与结合能没有显著的直接关联。

对IN-C1和IN-C6进行了显含水分子动力学模拟,RMSF与B因子较好的相关性证明了模拟方法以及的可靠性。

通过能量分解和氢键的分析,给出了IN-C1和IN-C6在水溶液中的最优结合模式,发现P142有利于C1、C6与HIV-1 IN识别结合,补充了相关数据。并就二者间的活性差异给出了合理的解释。氢键网络图的分析,对分子柔性变化做出了解释。

范德华能与lgIC50的相关性分析表明,通过计算此类DKAs的范德华能可以粗略预测其活性,辅助筛选具有良好活性的同类分子。另外,Corona等还发现DKAs对HIV-1逆转录酶的RNase H区具有一定的Inhibit作用。分子模拟结果与实验值吻合较好,为深入理解二酮酸类分子与整合酶的识别机制以及基于IN结构的分子设计提供一定的结构及理论支持。


2018年8月13日/0 评论/通过: jmwang
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/08/4-4.jpg 727 963 jmwang http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png jmwang2018-08-13 15:29:172019-07-10 11:12:31HIV IN与DKAs的分子模拟研究

提高Pt(Ⅱ)配合物磷光量子产率的研究

成功案例

背景

Pt(Ⅱ)配合物作为磷光材料在OLED领域具有巨大的发展潜力。研究表明,π共轭的增强不仅能使辐射速率常数增大,还有利于电荷的转移。

目的

深入探究增强配体π共轭与磷光量子产率之间的关系

研究结果

磷光是电子在处于不同自旋多重度间跃迁产生的一种发光现象,可由光吸收、电流和化学反应引起。如图1所示,当处于基态的分子吸收光能、电能或化学能后,电子受到激发。电子被激发到Sn态,Sn态电子可以失活回到S1态,也可以从单重激发态向三重激发态Tn跃迁,此时电子的自旋发生反转,处于Tn态的电子可以失活至T1激发态。若电子从S1态光淬灭到基态,产生的光辐射为荧光;若电子从T1态光淬灭至基态,产生的光辐射为磷光。但是,电子从激发态回到基态所释放的能量并非都是通过光辐射,还有非辐射途径,因此量子产率可以用来表示某一光化学或光物理过程中,被吸收的光子利用效率。

图1 磷光产生的原理

为了考虑分子轨道离域对于吸收光谱的影响,分别比较了四种泛函的模拟结果,如图2所示,发现PBE0泛函用于后续的吸收光谱理论计算。

图2 不同泛函模拟的配合物的吸收光谱(A)和PBE0泛函模拟的吸收光谱(B)

为了研究轨道离域对配合物电子跃迁特征的影响,图4给出了配合物的自然跃迁轨道。结果表明二者磷光发光的电子跃迁特征均属于MLCT和ILCT。

图3 配合物最低三重激发态的自然跃迁轨道分布

图4 为配合物磷光辐射过程中的原理图,从能量角度看,扩大配体的π共轭并没有显著影响非辐射过程中的能垒,但是仍然提高了限速步骤的能垒,分别提高了3.6 和1.4 kcal/mol。因此配体中π共轭的扩大有利于降低体系的非辐射过程,进而增加磷光量子产率。

2018年8月10日/0 评论/通过: jmwang
http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/08/3.png 1247 2236 jmwang http://www.modekeji.cn/wp-content/uploads/2018/09/modeweblogo-300x99.png jmwang2018-08-10 10:32:532020-04-09 09:27:33提高Pt(Ⅱ)配合物磷光量子产率的研究
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